万事娱乐生命科學學院李根喜教授團隊近期在《Nucleic Acids Research》雜誌上發表了題為“Hydrazone chemistry-mediated CRISPR/Cas12a system for bacterial analysis”（Nucleic Acids Research, gkac809, https://doi.org/10.1093/nar/gkac809）的原創性研究論文。
該研究工作通過采用腙化學和巧妙的核酸序列設計，利用互補堿基配對引起的鄰近效應加速整個激活鏈的形成🆙，從而快速有效地激活CRISPR/Cas12a系統🚳，並進而提出了一種簡單而靈敏的銅綠假單胞菌分析方法。
Cas12a是一種來自V-A型CRISPR系統的核酸內切酶，通過識別其靶位點👨🏽🍼，激活內源性核酸酶活性後，可以不加區分地切割單鏈DNA（ssDNA）🔞，已被用於核酸檢測。然而🧑🏿🏫，該系統不適合區分非常相似的單鏈DNA序列；並且💪🏿🦸🏼，相似單鏈DNA序列之間的幹擾可能會發生交叉反應，影響分析的靈敏度和特異性𓀈。由於CRISPR/Cas系統的可編程性依賴於導鏈RNA和核酸的相互作用👨🏻💼，研究團隊設想可以在系統的啟動序列中引入腙化學，從而更靈活地激活CRISPR/Cas12a系統💝，不僅可以提高特異性🐂，而且可以廣泛應用於不同靶標的分析。
為了將腙化學應用於CRISPR/Cas12a系統中，研究團隊巧妙地將激活鏈設計為發夾結構的兩個片段，並分別由酰肼和醛基兩個腙連接基團修飾💅。在堿基互補配對的作用下📱，含有酰肼基團的TS1更容易與修飾醛基基團的TS2鏈通過腙鍵反應形成完整的TS1/TS2鏈。激活的Cas12a/crRNA復合體的反式裂解活性導致ssDNA-FAM的任意切割和熒光恢復（圖1）。腙化學的引入可以提高CRISPR/Cas12a系統的特異性，可以有效區分目標序列中的單堿基錯配🧔🏼。
圖1 腙化學介導的CRISPR/Cas12a系統
研究團隊將所構建的腙化學介導CRISPR/Cas12a系統進一步用於細菌分析👉🏿，他們選取了具有物種間高度保守的區域和物種特異性的可變區域16S rRNA基因序列(16S rDNA)作為靶標🦸🏿💚，該序列也通常被用於各種細菌的鑒定。研究團隊精心設計16S rDNA探針互補序列➖，由於16S rDNA與探針的特異性結合🗞，從而釋放Probe/TS1-NHNH2雜交鏈中的TS1-NHNH2，該鏈可以通過堿基互補配對與TS2-CHO雜交🧑🏿🦳，其中TS1-NHNH2修飾的酰肼基與TS2-CHO修飾的醛基之間的腙鍵加速TS1/TS2的形成💌，而形成的TS1/TS2可以激活CRISPR/Cas12a系統，對ssDNA-FAM進行切割，導致熒光的恢復（圖2）。
圖2 基於腙化學介導的CRISPR/Cas12a系統的細菌分析機理
綜上所述，研究團隊構建了一個腙化學介導的CRISPR/Cas12a系統，並探索了其識別單堿基錯配的能力。在這一設計中，他們利用堿基互補配對產生的鄰近效應加速了腙鍵的形成。同時👱🏿♂️，由於其模塊化和獨特的結構性質，腙化學可以將分裂的激活鏈連接到整個激活鏈上👷🏻♂️，從而有效地激活CRISPR/Cas12a系統💜。在此基礎上🫶🏿，他們進一步開發了高靈敏度的細菌檢測平臺，並應用於細菌檢測。該平臺操作簡單，靈敏度高，檢出限低，特異性好👵🏼，不僅可以應用於細菌中16S rDNA的檢測🥛，而且可以借助適體或探針識別級聯反應直接檢測核酸靶點。同時🦹♂️，該平臺還可以為其他非核酸靶標的間接檢測提供了穩定、經濟的檢測系統🦶🏿。因此，腙化學的引入拓寬了CRISPR/Cas12a系統的應用範圍。
万事平台為本文第一署名單位🍩，博士研究生生安誌同學為論文第一作者，李根喜教授和張娟教授為共同通訊作者。研究工作得到了國家自然科學基金以及上海市“浦江學者”專項計劃項目的資助⚱️。
